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Observatoire océanologique de Banyuls sur mer
Laboratoire Arago

Cytometrie en flux: analyseur trieur de cellules

LES ANALYSEURS DE CELLULES:

Le FACSCan, BD Biosciences.


Ce cytomètre est équipé:

  • Un laser Argon: excitation à 488nm
  • Trois détecteurs de fluorescence: FL1: 530/30nm; FL2: 575/26nm; FL3: 650LP.
  • D'un ordinateur MACintosh disposant du logiciel d'acquisition "CellQuest" version3.

Le FACSCalibur, BD Biosciences.

Ce cytomètre est équipé de:

  • Deux lasers: un à 488nm, l'autre à 633nm.
  • Quatre détecteurs: FL1: 530/30nm, FL2: 585/40nm, FL3: 670LP,  FL4: 661/16nm
  • Du logiciel "CellQuest 3".

Le FACSCantoII, BD Biosciences.

Ce cytomètre comporte trois sources lumineuses:

  • Un laser bleu Argon dont le chemin optique (dit en octogone) permet de mesurer et séparer les signaux de fluorescence grâce à 4 détecteurs:  FL1: 530/30nm,  FL2: 585/42nm, FL3: 670 LP, FL4: 780/60nm.
  • Un laser rouge 633nm: filtres optiques Band Pass: 750/60nm, 650/20nm.
  • Un laser violet 407nm: filtres optiques Band Pass: 502-535nm, 425-475nm.

L'outil informatique sous windows XP dispose du logiciel d'analyse et traitements des données "Diva6".

Les appareils sont disponibles en service commun, la réservation du FACSCan se fait via le planning de réservation (accessible par le réseau intranet du laboratoire).

Toutes nouvelles personnes qui souhaitent utiliser les appareils doivent contacter (de préférence à l'avance) les responsables des appareils: Laëtitia Bariat, Claude Courties.

Les utilisateurs peuvent également bénéficier d'une formation et ou d'une technique s'ils le souhaitent.

Les applications en Océanographie:

La cytométrie en flux permet de comprendre la structure complexe des peuplements phytoplanctoniques, majoritairement constitués d'algues unicellulaires inférieures à 3 µm, et d'en suivre leurs évolutions saisonnières dans les écosystèmes aquatiques. Cette approche cellulaire des écosystèmes marins est à l'origine de l'évolution de la plupart des concepts développés en océanographie, particulièrement pour l'étude des cycles biogéochimiques dans les océans (cycle du carbone, de l'azote, interactions entre compartiments cellulaires vivants,... ).

La cytométrie en flux est aussi à l'origine de la découverte d'espèces nouvelles d'algues très abondantes et de très petites tailles (inférieure à 1µm), comme Prochlorococcus sp. (Chisholm et al. 1988) ou Ostreococcus tauri (Courties et al. 1994). Leur rôle primordial dans les chaînes trophiques océaniques est essentiellement étudié à l'aide de cytomètres en flux et trieurs de cellules, parfois embarqués sur des navires océaniques.

Ci-dessous, un exemple de peuplements phytoplanctoniques provenant de différents écosystèmes côtiers où chaque cellule est identifiée grâce à ses propriétés de diffusion lumineuse (relatives à la taille) et de fluorescence que l'on excite à 488nm à l'aide d'un laser argon.

LE TRIEUR DE CELLULES:

Le FACSAria, BD Biosciences

Ce trieur est constitué de:

  • Trois lasers: 407nm, 488nm, 633nm.
  • Deux couronnes de PMT, 6 à 14 fluorescences, 2 diffusions (détecteurs disposés en couronne autour des photons émis amenés par une fibre optique.
  • Analyse dans une cellules en quartz (sensibilité accrue).

  • Tri par déflection électrostatique dans l'air.
  • Quatre voies simultanées de tris possible, protégé des contaminations.

Application à la bactériologie marine:

Les bactéries marines, généralement très nombreuses (1million/mL), sont marquées à l'aide d'un fluorochrome des acides nucléiques (SyberGreenI) pour être facilement comptées en cytométrie en flux. Elles sont souvent caractérisées en deux ou trois populations faiblement (LNA) ou fortement fluorescentes (HNA) reflétant des états différents de leurs activités.

Le tri de fractions bactériennes, détectées sur la base des propriétés de taille apparente des cellules (SSC) et de la fluorescence induite de leur acides nucléiques (FL1), que l'on associe à des analyses spécifiques du métabolisme ou de caractérisation en biologie moléculaire, permet de préciser l'activité de ces bactéries ainsi que leur diversité encore largement inconnue dans les écosystèmes aquatiques.

Le cytomètre en phase solide

Le cytomètre en phase solide, couplé à un microscope à épifluorescence, est un outil indispensable pour détecter et quantifier, à l'aide de fluorochromes spécifiques, des bactéries pathogènes ou des algues toxiques dans les milieux aquatiques.

Le laboratoire Arago est l'un des rares parmi les laboratoires marins en Europe qui propose son utilisation dans l'environnement.

Exemple de la détection des algues toxiques dans l'étang de Thau, Programme Européen, DETAL (Détection of toxic algae)

Exemples pour les cellules pathogènes:

 

Laëtitia Bariat - 02/06/16